软枣猕猴桃受精后子房蛋白表达的2D-DIGE分析

时间：2015-10-04 来源：猕猴桃官网作者：奇异果

软枣猕猴桃受精后子房蛋白表达的2D-DIGE分析

齐秀娟^1，2，方金豹²，陈锦永²，顾红²，张绍铃¹

（¹南京农业大学梨工程技术研究中心，南京 210095；²中国农业科学院郑州果树研究所/果树生长发育与品质控制重点开放实验室，郑州 450009）

摘要：【目的】了解软枣猕猴桃(Actinidia arguta)受精前和受精后（授粉前和授粉后120 h）子房蛋白质组的变化，为阐明猕猴桃属植物双受精的分子机制提供依据。【方法】应用石蜡切片技术、差异凝胶电泳（DIGE）、质谱（MALDI－TOF/TOF）和生物信息学技术，对其授粉前及授粉后120 h的子房形态及蛋白质组变化进行分析。【结果】授粉后120 h，子房中的胚囊已经完成了双受精；用DeCyder V 6.5软件分析，在授粉前、授粉后120 h的子房中共检测到约1 500个蛋白质点，其中55个有差异表达；质谱鉴定了差异2.0倍以上的蛋白质点13个，其中8个获得理想结果，分别属于6种蛋白质；在6种差异蛋白质中，其中5种在授粉后子房中表达上调，只有1种表达下调。【结论】根据软枣猕猴桃受精前后子房差异蛋白表达谱比较，获得了几种与双受精过程相关的蛋白质分子。

关键词：猕猴桃；受精；子房；蛋白质组

Differential Protein Analysis of Chinese Gooseberry Ovary After Fertilization by a 2D-DIGE Approach

QI Xiu-juan^1,2, FANG Jin-bao², CHEN Jin-yong², GU Hong², ZHANG Shao-ling¹

(¹ Pear Engineering Research Centre, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095；² Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory for Fruit Tree Growth, Development and Quality Control, Zhengzhou 450009)

Abstract:【Objective】The changes of Chinese gooseberry (Actinidia arguta) ovary proteins and morphology before and 120 h after pollination were analyzed to provide valuable evidence for further elucidating the molecular mechanism of double fertilization.【Method】Fluorescence paraffin technique,differential in-gel electrophoresis (DIGE), Matrix-assisted laser-desorption/ionization Time of ﬂight/Time of ﬂight (MALDI-TOF/TOF) and bioinformatic technology were used in the experiment.【Result】The embryo sac in the ovary completed its double fertilization 120 h after pollination. About 1 500 protein points were detected by DeCyder 6.5 (Amersham Bioscience), and 55 proteins were differentially expressed at ovary before and 120 h after pollination. Thirteen protein spots (differential ratio＞2.0) were identified with MALDI-TOF /TOF, of these proteins,8 belong to 6 kinds of proteins. Five of the six proteins are up-regulated while one is down-regulated.【Conclusion】According to the expression differences of the proteins at ovary before and after fertilization, several proteins identified might be related to the process of the double fertilization of Chinese gooseberry.

Key words: Chinese gooseberry; fertilization; ovary; proteome

0 引言

【研究意义】果树双受精是其生殖发育的核心过

程，大多数情况下，受精作用的成功或失败决定了子房能否正常发育。猕猴桃属（ActinidiaLindl.）植物绝大多数为雌雄异株类型，受精作用能否完成决定坐果、

产量和最终果实大小。【前人研究进展】猕猴桃生殖生物学方面，Harvey对美味猕猴桃的雌株、雌雄同株和中华猕猴桃雌株的柱头、传粉后花粉管的生长、雌配子体的发育和受精有过报道^[1^-^3]；Biasi等观察了美味猕猴桃雄性不育花粉的生化和超微细胞结构特点^[4]；笔者针对全红型软枣猕猴桃，开展了花器结构和开花授粉生物学特性^[5]、授粉前后柱头及花柱中Ca²⁺超微细胞化学定位等方面的研究^[6]；另外还有一些关于猕猴桃花粉管的生长^[7^-^8]、早期胚胎发育^[8]等方面的研究报道，但与其它果树及农作物等草本植物的研究相比，猕猴桃属植物生殖生物学的研究多数停留在形态学描述水平。【本研究切入点】果树授粉受精是一个高度复杂的生理生化和形态变化的过程，这一过程必然会引起子房组织内一系列复杂的生理和代谢变化，这些变化是遗传信息在一定条件下选择性转录与顺序表达的结果^[9]。研究表明，基因及其表达的中间产物mRNA水平的研究并不能取代蛋白质水平的研究，虽然植物mRNA与表达的蛋白质存在相关性，但其相关程度不高，相关系数常低于0.5^[10]。因此，要精确研究与猕猴桃受精相关的各种基因的功能，还要回到执行生命功能的蛋白质本身上来。【拟解决的关键问题】本文拟通过软枣猕猴桃受精前后子房蛋白表达的2D-DIGE分析，以期获取一些差异表达的蛋白，并分析这些差异蛋白的生物学功能，旨在为探索猕猴桃属植物双受精分子机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

本试验于2010年在中国农业科学院郑州果树研究所猕猴桃资源圃（113°71′E，34°71′N）内进行。供试雌性品种为红肉软枣猕猴桃（Actinidia arguta）‘天源红’，授粉品种为同种软枣猕猴桃花粉。

在‘天源红’花蕾完全露白期，在花期一致、花质均一的单花上进行花前套袋。开花当天预先采集一批未授粉子房少量用FAA固定液（50%酒精﹕冰醋酸﹕37%甲醛=90﹕5﹕5）固定，其它放入冻存管迅速置于液氮中保存。在开花当天上午9：00进行同种花粉授粉，授完粉后立刻重新套袋，在授粉后120 h摘下花朵立刻取下子房同上进行处理保存。

1.2 试验方法

1.2.1 子房显微观察从固定液中取出子房，常规石蜡切片法制片，切片厚度8—10 µm，铁矾苏木精整体染色，在日本Olympus BX51型光学显微镜下观察、摄影。

1.2.2 蛋白质样品的准备样品分别用PBS洗3次，加入DIGE裂解液（含有7 mol·L^-1尿素，2 mol·L^-1硫脲，65 mmol·L^-1 Tris，4% CHAPS，0.2% IPG buffer and protease inhibitor）约1 mL，用Dounce’s 匀浆器匀浆。获得的混悬液用超声破碎细胞（80 W，5次，每次10 s，间隔15 s）。以上操作均在冰上完成。将混合物在4℃离心，15 000g，45 min，上清用Bradford法定量，分装后低温保存（-80℃）。

1.2.3 蛋白DIGE荧光标记根据试验设计（表1），用Cy3或Cy5（400 pmol，GE Healthcare，Munich，Germany）对两组的蛋白样品（50 μg）进行标记。两组间的染料交叉标记设计可避免染料优先标记造成的误差。所有样品等量混合后得到的混合内参用于控制胶-胶间变异，以Cy2标记。黑暗中冰上孵育30 min后，以1 μL的10 mmol·L^-1 L-lysine（Sigma）终止反应。

表1 2D DIGE试验设计

Table 1 The experimental design of 2-D DIGE

Gel No.	Cy2	Cy3¹⁾	Cy5²⁾
1	内标An internal pooled standard	A1	B2
2	内标An internal pooled standard	A2	B1
3	内标An internal pooled standard	A3	B3

¹⁾A1，2，3：授粉前的样品之一；²⁾B1，2，3：授粉120 h后的样品之一

A represents protein samples before pollination，the number followed means repetition；B represents protein samples 120 h after pollination

用于同一张胶上的Cy2、Cy3和Cy5标记蛋白（分别为50 μg）混合后加入等量的再水化缓冲液（8 mol·L^-1尿素，4% w/v CHAPS，130 mmol·L^-1 DTE，2% v/v Pharmalyte^TM pH 3–10）。等电聚焦以非线性IPG strip（13 cm，pH 3-10，GE Healthcare）在Ettan IPG-phor装置（GE Healthcare）中进行。电泳条件:20℃环境下，30 V 12 h 、500 V1 h 、1 000 V 1 h、,8 000 V 6 h、500 V 4 h。等电聚焦结束后，将IPG strip在平衡缓冲液中（50 mmol·L^-1 Tris-HCl，6 mol·L^-1尿素，30%甘油，2% SDS）中孵育，添加1% DTT，之后添加2.5%碘乙酰胺。平衡结束后，将蛋白在12.5% SDS-PAGE进行分离（Hoefer SE 600 Ruby 装置，GE Healthcare），参数设置为15 mA 15 min，之后在20℃ 30 mA条件下电泳直到溴酚蓝染料电泳至凝胶的底部。

1.2.4 凝胶图像获取与分析以Typhoon 9700图像

仪（Amersham Bioscience）获取凝胶图像，DeCyder 6.5差异分析软件（Amersham Bioscience）对图像进行分析处理。整个操作使用DeCyder DIA（Difference In-gel Analysis）和DeCyder BVA（Biological Variation Analysis）软件模块完成。每一匹配点的统计分析采用Student’s t检验比较了A组与B组蛋白丰度的均值和标准差，采用ANOVA比较了两组间的差异变化。由于DIGE的上样量较小，而且染料有可能影响质谱检测结果。因此，取每种蛋白质样品200 μg，各按与DIGE试验相同的电泳参数平行进行2-D电泳，快速银染，切取丰度具有显著性改变（比值＞2.0倍，P＜0.05）的蛋白质点用于质谱分析。

1.2.5 差异蛋白质点的酶解和鉴定参照曹晓艳等方法^[11]，质谱检测仪器为ABI 4800 Proteomics Analyzer MALDI-TOF/TOF。

1.2.6 蛋白质数据库检索获得的一级和二级质谱数据使用GPS Explore（软件版本号：V3.6，美国应用生物系统公司）软件进行分析，分析后的每一个样品的一级和二级质谱数据再整合成一个文件，使用MASCOT（V2.1，Matrix Science，London，U.K）搜库软件在2010年6月12日NCBInr的蛋白数据库中检索，物种为NCBI_Viridiplantae（NCBI_EST_ Actinidia），共有184 045个蛋白质序列被检索，2010年8月28日检索物种为NCBI_EST_Actinidia，共有132 577个蛋白质序列被检索。搜库参数设置：切割的酶为trypsin（promega），允许最大的未被酶切位点数为1，可变修饰为半胱氨酸乙酰胺化和甲硫氨酸氧化，没有固定修饰，母离子质量容差为50×10^-6，片段离子质量容差为0.25 Da。MASCOT检索蛋白质得分（基于一级和二级质谱数据联合搜库的结果）超过65分（P＜0.05）且二级质谱总离子得分超过34分（P＜0.05）的结果被认为可靠鉴定的结果，或者仅有二级质谱总离子得分超过34分（P＜0.05）的结果也被接受。