齐秀娟1，2，张绍铃1，方金豹2※
(1南京农业大学园艺学院，南京 210095;2中国农业科学院郑州果树研究所，果树生长发育与品质控制重点开放实验室 郑州 450009)
摘要：采用离体培养法，在筛选出最佳培养基后，研究猕猴桃花粉在不同培养时间、pH值、温度条件下花粉萌发和花粉管生长状况。结果表明：猕猴桃花粉离体萌发及花粉管生长的最适培养基为10%蔗糖+100mg/L硼酸+10mg/L Ca(NO3)2;离体培养最适观察时间为5.0h，最适培养温度为30℃，最佳培养pH值为6.0。
关键词：猕猴桃;培养条件;花粉萌发率;花粉管伸长
Effect of Environment on Pollen Germination of Kiwi
Qi Xiu-juan1，2，ZHANG Shao-ling1,FANG Jin-bao2
(1Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095;2Key Laboratory for Fruit Tree Growth, Development and Quality Control, Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450009)
Abstract：
The paper reports factors influencing pollen germination and tube growth of kiwi in vitro.With this one, the effects of different time, pH values, different storage temperatures and many amines were tested. The results showed that the most suitable culture medium for pollen germination and tube growth was 10%sugar+100mg/L boric acid+10mg/L Ca(NO3)2.The suitable watching time was after 5 hours, the best temperature for pollen germination and growth was 30℃ and the suitable pH value of culture medium was 6.0.
Key words：Kiwifruit;Effect of Environment; Pollen germination;Pollen tube growth
猕猴桃是雌雄异株的重要果树树种，生产中需要严格配置授粉树，但有时因花期不遇、恶劣天气或授粉昆虫数量的不足，导致授粉受精不良，而授粉受精是其丰产的基础，所以仅依靠天然授粉猕猴桃很难获得优质高产，故采用人工辅助授粉显得尤为必要。花粉萌发对授粉受精起着关键作用【1】，花粉萌发的好坏，除与花粉本身的质量有关外，与花粉萌发的环境条件和贮藏条件有密切关系[2]。关于猕猴桃人工辅助授粉的采粉时期、花粉贮藏条件以及Ca(NO3)2、Na6Mo7O24、MnSO4、NaCl、蔗糖、硼酸等因子对猕猴桃花粉的影响前人已做过一些研究[3，4，5]，但花粉离体萌发最佳环境条件的研究则尚未见报道。本试验以美味猕猴桃花粉为研究材料，探讨其花粉的最佳离体培养环境条件，其结果可为猕猴桃生产上人工辅助授粉提供理论依据。
1.材料和方法
1.1材料：
材料于2009年5月初选用中国农业科学院郑州果树研究所猕猴桃资源圃内同
期开花的自选美味猕猴桃雄株品系‘郑雄1号’和‘郑雄2号’。采集位于树冠外围中部的大蕾期中心雄花, 用羊皮纸袋包好，迅速带回实验室，用镊子摘下花药，在硫酸纸上均匀摊晾干燥，任其花药自然开裂散粉。待花药充分裂开后收集花粉，装入干燥的小瓶中并密封，将小瓶放入盛有干燥剂的密闭容器中，放置到-20℃冰箱中贮存备用。
1.2花粉培养法：
采用固体培养基培养法，即在设定培养基中按体积比加入0.8%琼脂，在微波炉中溶化好后，趁热用玻璃棒滴一滴培养基于凹形载玻片上，待培养基表面凝固以后，用头发丝条播花粉，置于事先准备好的铺上湿滤纸的培养皿中。培养箱中进行暗培养。在40×10倍显微镜下观察统计，并用分析测量图象软件Imagepro-Plus进行花粉管长度测量。花粉萌发以花粉管生长长度超过花粉粒直径作为已萌发依据， 每处理统计4个视野，每个视野花粉不少于20粒，重复4 次。在观察花粉萌发过程中，对花粉各个时期形态进行拍照。借助EXCEL辅助计算进行试验数据差异显著性分析。
1.3试验处理
1.3.1最适培养基筛选：选择‘郑雄1号’品种进行最佳培养基筛选试验。最适培养基参照姚春潮[6]等的培养基组成，以蔗糖、硼酸、Ca(NO3)2为培养基组分，设计3因子4水平的正交实验方案(表1)设定各成分含量，pH值6.5，培养温度26℃，培养5h，根据所观测的萌发率和花粉管长度，确定最佳培养基组分。
1.3.2最适培养温度筛选：采用‘郑雄1号’花粉进行该试验。应用实验筛选出的最佳培养基(第6种培养基, 其组分见表1)为基本培养基，调pH值6.5，设置培养温度(18、22、26、30、32、34、38℃)进行培养，5h后取出测其萌发率及花粉管长度。
1.3.3最适培养时间测定：采用‘郑雄1号’和‘郑雄2号’两个品种进行该试验。应用实验筛选出的最佳培养基(第6种培养基，其组分见表1)为基本培养基，设定培养温度26℃，调pH值6.5，设置培养时间(0.5、2.0、5.0、12、48h)进行培养，取出测其萌发率及花粉管长度。
1.3.4最适培养pH值测定：采用‘郑雄1号’花粉进行该试验。应用实验筛选出的最佳培养基(第6种培养基, 其组分见表1)为基本培养基，设定培养温度26℃，设置培养pH值(4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0)进行培养，5 h后取出测其萌发率及花粉管长度。
2.结果与分析
2.1不同培养基对猕猴桃花粉萌发和花粉管生长的影响
研究表明，猕猴桃花粉在不同培养基上的萌发率和花粉管生长长度表现不同(表1)。在13、14、15、16四种培养基上几乎不萌发，在第5、6、7、9、10、培养基上均能较好的萌发，萌发率达到50%以上，其中在第6种培养基上萌发率最高，达到了78.2%，与其它几种处理差异显著;从花粉管生长长度来看，也是在第6种培养基上生长最长，达到159.8um，与其它几种处理差异显著。因此认为，第6种培养基最适宜于猕猴桃花粉的萌发和花粉管生长研究，其组分为: 10%糖+100mg/L硼酸+10mg/LCa(NO3) 2·4H2O。
培养基编号Code of medium蔗糖浓度
Concentration of Sugar/%硼酸浓度Concentration of boric acid /mg/LCa(NO3)2浓度Concentration of Ca(NO3)2/mg/L花粉萌发率
Rate of pollen germination/%花粉管长度
Pollen tube length/um
1550535.6Db29.6Gb
251001038.9Db35.2Fb
351505046.7Cb38.5Fb
4520010032.1Db23.4Gb
51050569.5Ba138.4Ba
6101001078.2Aa159.8Aa
7101505063.2Ba122.2Ba
81020010048.2Cb115.7Ba
91550554.4Cb114.2Ba
10151001055.8Cb108.4Ca
11151505035.2Db99.7Ca
121520010022.5Eb55.6Eb
13205052.2Fc89.7Da
1420100102.8 Fc42.5Fb
1520150500 Fc0Hc
16202001000 Fc0Hc
2.2温度对花粉萌发和花粉管生长的影响
由图1可见，在18℃时，猕猴桃花粉并不萌发，说明该温度低于猕猴桃花粉萌发的极限低温。随着培养温度的升高花粉的萌发率也升高，培养温度为3O℃时花粉萌发率达到最大值为85.8%，萌发率与26℃相比差异不显著，与其它5个处理差异显著;当温度超过3O℃以后，其萌发率迅速下降，32℃花粉的萌发率仅为22.7%;在34℃时萌发率基本为0，在38℃时萌发率为0，说明该温度超过了花粉萌发的极限高温。
由图2可见，培养温度为3O℃时花粉管长度均达到最大值为198.6um，与其它几种处理表现差异显著;温度32℃时花粉管长度为53.6um，仅为30℃时的27%;在34℃时只有零星花粉管生长，平均长度为26.6um，且在此温度下，花粉管大都比较粗短，且易破裂，未萌发即破裂的花粉较多，通过测量34℃和38℃条件下的花粉直径，后者平均比前者增大了3.41um，说明温度过高不仅抑制了花粉的萌发，阻碍花粉管的伸长，还会使花粉管、花粉本身显著膨胀。
试验表明，26～30℃范围内是花粉萌发和花粉管生长较适宜温度，30℃是花粉培养最适温度。培养温度过高或过低都会抑制猕猴桃花粉的萌发和花粉管生长。
2.3培养时间对花粉萌发和花粉管生长的影响
图3、图4分别代表不同培养时间处理对‘郑雄1号’和‘郑雄2号’两个品种花粉萌发率和花粉管生长的影响。
由图3可见，在培养0.5～5h时间范围内，随着培养时间的增长，花粉萌发率表现增加，培养5h时，花粉萌发率分别为76.4%和55.3%，与培养0.5h和2.0h达到了显著差异;‘郑雄1号’在培养0.5h和2.0小时范围内，增加幅度不大，差异未达显著水平，‘郑雄2号’虽然达到了显著差异，但增加只有14%;在培养2～5h范围内花粉萌发率急剧上升，‘郑雄1号’与0.5h时相比增加了66.1%，‘郑雄2号’与0.5h时相比增加了44.1%;在培养5～12h范围内‘郑雄1号’萌芽率上升缓慢，二者数据未达显著差异水平，‘郑雄2号’上升较多，达到了显著差异水平。在12～48h内‘郑雄1号’变化较大，数据达到显著差异，‘郑雄2号’变化较小，数据未达到显著差异水平。
由图4可见，培养不同时间对猕猴桃花粉管生长长度表现明显不同。在培养0.5～5h时间范围内，随着培养时间的增长，花粉管长度总体表现增加趋势;培养0.5h和2.0小时范围内，增加幅度不大，均未达到显著差异水平，两个品种表现相似的趋势;在培养2～5h范围内花粉管长度显著增加，在培养5h时，‘郑雄1号’花粉管长度平均为155um，‘郑雄2号’花粉管长度平均为108.2um，分别为培养0.5h时的3倍和3.66倍;在培养5～48h范围内‘郑雄1号’花粉管长度表现略有下降趋势，48h时的花粉管长度显著低于5h时的花粉管长度;‘郑雄2号’在5～12小时内花粉管长度表现上升，在12～48h内，花粉管长度表现平缓。
基于两个品种培养5h之后萌芽率和花粉管长度表现趋势并不完全一致，所以认为离体培养时间5h较为适宜。
2.4培养基pH 值对花粉萌发和花粉管生长的影响
图5、图6表示培养基的pH 值对花粉萌发和花粉管生长有明显的影响。由图5可见，在pH4～5 的范围内花粉萌发率没有明显变化，pH4时萌发率为52.8%，pH5时萌发率为53.2%;在pH5～6范围内萌发率表现明显上升，且在pH6.0时达到最大值，萌发率为81.5%，与其它几种处理达到了显著差异;以后随着pH上升，萌发率表现下降，pH=7时萌发率为34.6%，在pH﹥7后萌发率几乎为0。
从图6可见，在pH4～5 的范围内花粉管长度没有明显变化，pH4时花粉管长度为130.9um，pH5时花粉管长度为129.8um;在pH5～6范围内花粉管长度表现明显上升，且在pH6.0时达到最大值，花粉管长度为261.2um，与其它几种处理达到了显著差异;以后随着pH上升，花粉管长度表现下降，在pH=8.0时只有零星花粉管生长，在pH=9.0时无一花粉管生长。
本研究表明，猕猴桃花粉萌发和花粉管生长的最适pH 值是6.0，即猕猴桃花粉适合于在微酸性培养基上萌发和生长。
3.讨论
花粉萌发和花粉管的伸长速率对受精至关重要。如果速率过低，花粉管在到达子房之前胚珠就会退化，导致不能受精，从而影响坐果。花粉离体萌发试验的结果在某种程度上可以代表花粉粒在果园内的实际受精能力，二者具有一定的联系。
花粉萌发及花粉管生长是一个极其复杂的生理代谢过程，在离体培养时不仅受培养基组分的影响，也与培养的环境因素有很大关联。猕猴桃新鲜花粉生活力较高【7】，但在柱头上能否萌发还受到各种环境因子的影响。温度是影响花粉活力变异的最主要来源，在花粉生长的过程中，花粉粒内化学物质对外界温度的反应敏感【8】。各种植物只有在自己最适温度范围内，萌发率才会高，低于或高于这个温度就会使萌发受到影响。也就是说，在温度较低时花粉活力低，随着温度的升高活力增强，但是温度升到一定值后再升高将对花粉的活力有抑制作用[9]，这与生物体内酶的特性相似，最适温度主要取决于植物的生理特点和其内反应酶的特性。研究表明，猕猴桃花粉萌发受温度的调控非常明显，离体培养的最适宜温度范围为26～30℃，最适宜温度为30℃。郑州猕猴桃资源圃雄株开花期通常在5月初，据2009年田间温度记录仪调查5月1日～5月15日果园小气候温度在14～35℃左右，在正常气候条件下不会影响雄株花粉的散布与传播，但是如遇阴雨天、花期低温或异常高温，很难正常散布花粉，导致授粉受精不良，坐果率偏低或果实发育畸形。所以授粉受精不良是郑州地区猕猴桃果实表现畸形的重要原因之一。如人工杂交授粉，也应选择温度适宜且晴朗无风的天气进行。黄家兴[10]等研究表明凯特杏花粉的萌发和花粉管生长的最适温度范围是15～25℃;吴开志等[11]研究表明核桃花粉的最适宜培养温度为25℃;杜玉虎等[12]研究表明果梅花粉的培养适宜温度为25℃;Kakani等[13]研究表明棉花花粉萌发和花粉管生长适宜温度为32℃。从以上不同的研究结果可以看出，不同的植物间花粉萌发和花粉管生长的最适宜温度存在一定差异。
培养基中适宜的pH值是保证花粉萌发和花粉管生长的重要条件，过高或过低的pH 值都会抑制花粉萌发和花粉管生长。张绍铃等[14]研究表明梨花粉萌发和花粉管生长所需的最适pH值为6.5;赵艳玲等[15]研究表明萝卜花粉离体培养的最适宜pH为7.0;黄家兴等[10]研究表明凯特杏花粉萌发和花粉管生长最适pH 值为6.0。本研究中猕猴桃花粉培养适宜pH值为6.0，这与黄家兴等[9]的研究结果相近，但不同的植物间花粉的萌发率及花粉管生长所需的pH值还是存在一定差异。
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