猕猴桃花粉原位生长过程中Ca2+的超微细胞化学定位

1.1材料

试验于2010年5月采用中国农业科学院郑州果树研究所猕猴桃资源圃（113°71′E，34°71′N）内的软枣猕猴桃（A. argutar）品种‘天源红’进行，该品种在郑州地区花期为5月6日～11日。在大蕾期用中国农业科学院郑州果树研究所果袋公司生产的石榴专用羊皮纸袋进行单花套袋，在开花当天上午9时用事先准备好的同种花粉进行人工点授，授完粉后再立即重新套袋。

1.2方法

1.2.1花部特征观察

在初花期上午9时左右选择树体中部、树冠外围的典型花朵，肉眼观察花的结构特征。

1.2.2荧光显微镜观察

在授粉前、授粉后3h和7h，分别采集花朵用冰壶带回实验室，立即用刀片从花柱基部（子房与花柱连接处）切取花柱（含柱头），FAA固定液固定。花柱的压片参照Kho等^[6]的方法，从固定液中取出花柱，用蒸馏水冲洗2遍，用2mol×L^-1的NaOH放置在65℃的恒温箱中软化处理3h，然后用0.1mol×L^-1K₃PO₄溶液配制的0.1%的苯胺兰染色液染色3h。染色后的花柱做成压片，用日本OLYMPUS BX51型荧光显微镜观察花粉萌发和花粉管的生长情况，各处理分别观察5朵花的10根花柱，选取典型图片拍照。

1.2.3扫描电镜观察

取授粉前和授粉后3h的柱头样品用2.5%戊二醛和1%锇酸双固定，经0.1 mol×L^-1磷酸缓冲液（pH7.8）冲洗、丙酮梯度脱水、醋酸异戊酯置换、临界点干燥、粘样和喷金后, 置于XL30ESEM环境扫描电镜下，观察柱头表面结构及花粉与柱头的附着状态并拍照。各处理分别观察5朵花的10根花柱柱头，选取典型图片拍照。

1.2.4 Ca²⁺超微细胞化学定位

采用焦锑酸钾沉淀法进行Ca²⁺的超微细胞化学定位。在授粉前、授粉后3h和7h分别选择5朵花，用单面刀片切取柱头、花柱顶端（柱头下1mm处）和花柱基部（子房上1mm处）1mm左右，将样品迅速投入到含2.5％戊二醛和2％焦锑酸钾的0.1 mol× L^-1磷酸缓冲溶液（pH7.8）配制的前固定液中室温下抽气并固定3h，然后用含2％焦锑酸钾、0.1 mol× L^-1磷酸缓冲溶液（pH7.8）配置的洗涤液清洗3次，每次30min，再将材料转入0.1mol× L^-1磷酸缓冲溶液配制的含1％锇酸、2％焦锑酸钾的后固定液中在4℃下固定16h左右，用相同的洗涤液清洗3次，每次30min。系列梯度丙酮脱水，Epon812树脂包埋。包埋的柱头和花柱材料用超薄切片机切片，切片厚度为70nm，切片不进行染色，用日立Hitach-6050型透射电子显微镜观察和拍照。

2结果与分析

2.1‘天源红’的花部特征

    ‘天源红’为软枣猕猴桃雌性品种，单花或二歧聚伞花序，每花序有花1～3朵，辐状花冠，冠径约15～18mm；花萼5～6片，偶有4片，绿略带红色，卵形；花瓣白色，略有片状红晕，近圆形，基部相接，边缘无波皱，中间有一浅裂；雄蕊多数，花药黄黑色，花粉粒空瘪，花丝退化或极短；单花花柱21～23个，长度（0.42±0.25）cm，白色，斜生或水平；子房上位，瓶状，绿色，纵径长（2.68±0.18）mm，无毛。（图版Ⅰ，1）。

2.2花粉粒在柱头表面的萌发和花粉管生长路径

 通过荧光显微镜观察发现，‘天源红’授粉后3h，很多柱头上花粉粒大量萌发，多数花粉管已经穿过柱头表面，进入柱头内部（图版Ⅰ，2）。授粉后7h，很多花粉管已生长到花柱底部（图版Ⅰ，3）。通过扫描电镜观察柱头具有一道裂沟(图版Ⅰ，4)，表面有大量乳突细胞分布，无黏液分泌，乳突呈长圆柱形，顶端呈钝圆、尖凸或凹陷三种形态(图版Ⅰ，5)。比较授粉前(图版Ⅰ，5)和人工授粉后3h (图版Ⅰ，6)的柱头， 二者形态差异不明显，仅个别乳突细胞表面纹理增多、凹陷变深。无论在光镜下还是在电镜下都可以观察到萌发后的花粉管从乳突细胞的间隙进入柱头的内部(图版Ⅰ，2和图版Ⅰ，6)。

2.3授粉前后Ca²⁺分布的变化

2.3.1授粉前后柱头Ca²⁺的分布变化

‘天源红’柱头为干性柱头，柱头的乳突细胞下面为花柱引导组织。乳突细胞相对的内表面为花粉接受面，外表面为非接受面。在未授粉的大蕾期，靠柱头外围角质层一侧细胞壁、细胞质、线粒体、内质网、液泡等细胞器里均含有许多Ca²⁺颗粒（图版Ⅰ，7），而在柱头非接受面表皮细胞壁中Ca²⁺几乎没有分布（图版Ⅰ，8），这种Ca²⁺分布状态与离体花粉萌发和花粉管生长时需要胞外Ca²⁺的试验结果相一致。

授粉后3h，柱头细胞壁外围、细胞质里有一些Ca²⁺颗粒沉淀（图版Ⅰ，9）。授粉后7h柱头细胞外表的细胞壁靠角质层一侧和液泡里仍分布有丰富的Ca²⁺颗粒（图版Ⅰ，10），随着柱头上附着的花粉萌发、花粉管的生长，花粉粒的萌发孔处的细胞壁中也出现很多Ca²⁺沉淀颗粒（图版Ⅰ，11），这些Ca²⁺沉淀可能与形成花粉管极性有关^[7]。随着花粉管穿过柱头细胞向花柱引导组织中生长，在花粉管顶端壁中出现大量非常细小的Ca²⁺颗粒（图版Ⅰ，12），推测这些Ca²⁺沉淀可能与花粉管的转向生长有关^[8-10]。柱头细胞质内还可见较大黑色颗粒（图版Ⅰ，13）推测可能是细胞质降解时产生的浓缩。同时，柱头非接受面授粉后Ca²⁺颗粒分布仍然很少（图版Ⅰ，14）。

2.3.2授粉前后花柱的Ca²⁺分布变化

猕猴桃花柱为闭合型，中央为引导组织，四周是具有较大细胞间隙的薄壁细胞组织。其中，引导组织是花粉管生长的通道，其胞间隙较发达。

未授粉前，花柱顶部Ca²⁺沉淀较少，主要均匀分布在细胞质中贴近质膜的位置，且颗粒相对较大，在引导组织胞间隙的中央、薄壁组织以及细胞壁中几乎没有Ca²⁺沉淀（图版Ⅰ，15）；基部Ca²⁺数量较多，主要分布在引导组织胞间隙中，而且颗粒较大（图版Ⅰ，16），同时在细胞质膜和细胞壁内壁上也有少量较大颗粒的Ca²⁺沉淀。说明在授粉前花柱的顶端和基部组织已经出现了一个Ca²⁺梯度。

授粉后3h花柱顶端Ca²⁺的分布位置和沉淀量未见明显变化；在花柱基部，Ca²⁺大量沉积在细胞质内，而胞间隙未见存在（图版Ⅰ，17）。上述结果显示，授粉后3h，由于花粉管生长刚刚穿过柱头乳突细胞，花柱顶端的Ca²⁺相对较少而花柱基部的Ca²⁺相比较很多，Ca²⁺的梯度分布特征仍然保持。

授粉后7 h花柱顶端引导组织的横切面上（图版Ⅰ，18）可看到花粉管壁最外层, 即果胶质层及靠近管壁的胞间基质中，有少量的Ca²⁺沉淀；引导组织细胞壁内膜上积累了大量细小的Ca²⁺颗粒，在胞间隙里却未见分布（图版Ⅰ，19）。在花柱基部Ca²⁺颗粒主要分布在细胞质、内质网等部位，而在引导组织胞间隙、细胞壁内膜等部位没有Ca²⁺分布（图版Ⅰ，20）。透射电镜观察授粉后7h花柱顶部和基部的Ca²⁺沉淀量大致相同，说明当花粉管已生长到花柱底部进入子房以后，Ca²⁺分布位置明显变化，而且花柱中Ca²⁺梯度作用会减弱甚至消失。

3 讨论

3.1柱头表面内Ca²⁺的分布及其作用

很多种类的植物在接受花粉的柱头上都会积累大量的Ca²⁺，例如金鱼草^[11]、番薯^[12]、假叶树^[13]、油菜^[14]、向日葵^[15]、棉花^[16]、水稻^[17]、甘蓝^[18]、烟草^[19]、莴苣 ^[20]等，这些Ca²⁺多分布于细胞壁和胞间基质等质外体系统中，均与其柱头上花粉的萌发有关。在本研究中，猕猴桃未授粉的柱头上，靠柱头外围角质层一侧细胞壁、细胞质、线粒体、内质网等细胞器里均含有许多Ca²⁺颗粒；授粉后3h，柱头细胞壁外围、细胞质里仍有一些Ca²⁺颗粒沉淀；授粉后7h柱头细胞外表的细胞壁靠角质层一侧和液泡里仍分布有丰富的Ca²⁺颗粒。这些丰富的Ca²⁺颗粒也与其柱头表面的花粉萌发有关。上述结果与很多植物花粉离体萌发实验中需一定Ca²⁺的原因相一致，表明离体花粉萌发和花粉管伸长需要从培养基中吸收胞外Ca²⁺的过程在体内由柱头表皮细胞提供，离体和体内试验结果相一致。

3.2花柱内是否存在Ca²⁺分布梯度

花柱内Ca²⁺是否具有梯度分布在不同植物上的研究结果不尽一致。在油菜^{14]，向日葵^[15] 、陆地棉^[16] 和水稻^[17]等植物中没有发现Ca²⁺的梯度分布现象。在金鱼草^[11]雌蕊组织中的研究表明存在着从柱头到胚珠Ca²⁺增加的梯度。烟草^[19]中Ca²⁺沉淀颗粒呈梯度分布，越接近子房，引导组织之间的细胞壁中的Ca²⁺颗粒越多。在莴苣^[20]中，授粉前花柱中的Ca²⁺虽不多，但从花柱顶端至基部的引导组织和其外围的薄壁组织中已呈现出了明显的Ca²⁺颗粒递增的梯度分布特征。本研究认为猕猴桃花柱顶端和基部在授粉前和花粉管刚刚穿过柱头生长没有到达柱头底部前存在Ca²⁺分布梯度，而在花粉管穿过花柱基部以后这种Ca²⁺梯度就会减弱或消失。分析不同植物Ca²⁺分布梯度存在与否的原因，有研究认为的向日葵、陆地棉、水稻不存在Ca²⁺梯度可能与该三种植物花柱很短，授粉到受精的时间为数小时到十余小时，花柱中无需Ca²⁺的梯度分布定向吸引^[19]的结论似乎与本研究结果相矛盾，‘天源红’花柱只有4mm左右，而且在授粉后7h，花粉管生长就已经到达花柱底部进入子房，在花粉管没有到达花柱底部前，Ca²⁺梯度依旧存在，定向吸引花粉管生长，而花粉管完全进入子房开始生长以后，花柱中的这种Ca²⁺梯度作用就会减弱或者消失。所以，不同植物花柱中Ca²⁺梯度分布的差异有可能与植物的种类和检测时间有关。至于猕猴桃子房中的胚囊各部位与花柱间是否存在Ca²⁺梯度问题需要进一步开展研究方能确定。

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